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本试剂盒适用于微量蛋白质浓度的测定，其最小检出量为25μg/mL，在50～2000μg/mL浓度范围内有较好的线性关系。

BCA法与传统方法相比，操作更简单、试剂及其形成的颜色复合物更稳定、灵敏度更高。BCA法测定蛋白浓度兼容性亦很好，不受大部分样本中其他成分的影响，对于5%以内的去垢剂如SDS、Triton X-100、Tween 20、Tween80、NP-40具有很好的兼容性，但易受螯合剂、还原剂等的影响，在测定蛋白浓度前应尽量使样本满足如下要求：EDTA浓度≤10mM、DTT浓度≤1mM、2-ME≤0.01%、无EGTA。

• 蒸馏水、生理盐水或PBS
  
• 酶标仪或分光光度计、EP管、96孔板或比色皿、恒温箱或水浴锅

• 蛋白标准(BSA)粉末溶解于蛋白标准配制液后，即获得蛋白标准原液(即20mg/mL的蛋白标准)，该原液中含有防腐剂，不影响后续检测，该蛋白标准原液-20℃长期保存。
  
• 待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于同样的溶液中，否者待测蛋白与蛋白标准中所含非蛋白成分不一致，有可能导致测定不准确。
  
• 如果检测效果不佳，可以室温放置2h或60℃放置30min，颜色会随着时间的延长不断加深，显色反应也会随温度升高而加快；如果浓度较低，可以适当延长孵育时间或在较高温度下孵育。
  
• 测定标准曲线时发现随着标准品浓度的增加，吸光度或颜色没有明显变化，可能的原因是样品中含有严重干扰BCA法测定蛋白浓度的物质。
  
• 如检测样本中含有较多螯合剂、还原剂等影响因素时可考虑Bradford法测定。
  
• 因BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，建议每次测定时都作标准曲线，且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则每次都做标准曲线。
  
• 如果没有酶标仪也可以用普通的分光光度计测定，但应考虑比色皿的最小测定体积，按比例适当加大BCA工作液的用量使总体积不小于最小检测体积，样品和标准品的用量亦相应按比例放大；使用分光光度计测定蛋白浓度时，可以测定的样品数量会显著减少。
  
• 为了加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当加热，但切勿过热，否则易失效。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。
  
• 为了加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当用微波炉加热，但是切勿过热。室温保存。蛋白标准配制成溶液后-20℃冻存。

• 取1mL蛋白标准配制液加入到含有20mg的蛋白标准(BSA)中，充分溶解后配制成20mg/mL的蛋白标准溶液，配制后可立即使用，配制的蛋白标准溶液应-20℃保存。
  
• 取适量的20mg/mL蛋白标准溶液，稀释至终浓度为500μg/mL，如取25μL蛋白标准(20mg/mL)，加入975μL稀释液，充分混匀即配制成500μg/mL蛋白标准溶液。
  
  • 待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于同样的溶液中，一般可用0.9%NaCl或PBS作为BSA的稀释液，稀释后的500μg/mL蛋白标准溶液也应-20℃长期保存。
• 根据样品数量，取试剂A、B按50∶1的比例配制BCA工作液，即取50份BCA试剂A和1份BCA试剂B，充分混匀，即获得BCA工作液()；例如取5mL BCA试剂A和0.1mL BCA试剂B，配制成5.1mL BCA工作液，BCA工作液室温24小时内稳定。
  
  • 正常BCA工作液应为苹果绿或墨绿色，如变为紫色或其他颜色应弃用。
• 将500μg/mL蛋白标准溶液按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板或EP管中，加稀释液补足至20μL，其蛋白标准浓度依次为0、25、50、100、200、300、400、500μg/mL。
  
• 加20μL待测蛋白到96孔板或EP管中，如果样本不足20μL，用稀释液补足至20μL。
  
  • 如果标准品稀释液与溶解待测蛋白的溶液不同，应在待测蛋白中加入20μL稀释液；如果标准品稀释液与溶解待测蛋白的溶液相同，无需在待测蛋白孔中加入20μL稀释液，以减少不同溶液的差异。
• 向各孔或EP管加入200μL配制好的BCA工作液，迅速混匀，37℃孵育30～60min。
  
• 冷却至室温，立即用酶标仪或分光光度计测定562nm波长处吸光度(如无562nm，540～595nm之间的波长也可)，各孔或EP管吸光度减去蛋白浓度为0μg/mL的标准管的吸光度，以求得的差值为纵坐标：以标准孔或EP管中蛋白浓度(μg/ml)为横坐标，得出标准曲线及回归方程，根据标准曲线计算出待测样品的蛋白浓度。

• 对于10～50μg/mL范围内的蛋白样品，要充分考虑如EDTA、2-ME、DTT等干扰因素，其检测结果波动较大，标准品亦有波动，请注意小心精细操作，建议采购微量BCA蛋白定量试剂盒(货号：GL2337)。